Koło Naukowe WNB

Tematy dostępnych prac badawczych w ramach KNWNB

Sekcja środowiskowa

  • Współudział w badaniach populacji płazów podczas wiosennej migracji - ochrona czynna płazów na bydgoskim Łęgnowie.

Koordynator akcji, główny wykonawca: mgr Barbara Szulc

Nadzór nad uczestnictwem studentów w pracach: mgr Ewa Wachowiak-Świtała 

Działania odbywają się corocznie w okresie wiosennym przy współpracy z Urzędem Miasta Bydgoszcz i firmą KulNatura. Polegają na budowie ogrodzenia uniemożliwiającego wejście płazom na jezdnię i wkopaniu wiader do których wpadają migrujące wzdłuż ogrodzenia płazy. Systematyczne kontrole pozwalają na identyfikację migrujących gatunków, określenie płci i liczebności oraz przeniesienie osobników (poprzez jezdnię i torowisko) do zbiornika wodnego w celu odbycia godów.

  • Założenie półnaturalnych łąk kwietnych w mieście - projekt MEiN - mgr Ewa Wachowiak-Świtała (Katedra Biologii Środowiska)
  • Analiza dynamiki zmiany struktury bakterioplanktonu w stawie Ogrodu Botanicznego Uniwersytetu Kazimierza Wielkiego - dr Łukasz Kubera (Katedra Mikrobiologii)

Sekcja eksperymentalna

  • Czy woda w plastikowej butelce PET jest szkodliwa?- zastosowanie testu Allium do oceny cytotoksyczności i mutagenności wody z opakowań typu PET - dr Małgorzata Siatkowska i dr Katarzyna Robaszkiewicz (Katedra Biochemii i Biologii Komórki) 

Przy produkcji plastikowych opakowań z polimeru o nazwie politereftalan etylenu (w skrócie PET) wykorzystywanych jest wiele chemicznych substancji i tylko część z nich (około 25%) została przebadana pod kątem toksyczności. Materiał służący do opakowania wody czy też żywności teoretycznie nie powinien wpływać na jej właściwości. Badania wskazują jednak, że z butelek plastikowych typu PET mogą uwalniać się szkodliwe substancje, tj.: antymon, ftalany, aldehyd mrówkowy i aldehyd octowy [1-4]. Antymon w postaci trójtlenku stosowany jest jako katalizator przy produkcji butelek, stąd jego zawartość w ich składzie. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) określiła antymon (Sb) jako substancję toksyczną i niebezpieczną dla ludzkiego zdrowia. Podczas krótkiego i prawidłowego przechowywania wody w butelkach PET, uwalnianie szkodliwych substancji jest niewielkie i zazwyczaj mieści się w zalecanych normach. Jednak w przypadku przechowywania wody w plastikowych butelkach w wysokiej temperaturze lub w temperaturze pokojowej lecz przez dłuższy czas, stężenie Sb i innych niepożądanych substancji może rosnąć i przekraczać dopuszczalne limity. Kwestia przenikania z butelek PET do wody potencjalnie szkodliwych dla środowiska naturalnego oraz dla człowieka substancji wymaga dokładniejszych badań, ponieważ ich toksyczność jest jeszcze mało poznana.

Test Allium jest rekomendowaną, stosunkowo łatwą i szybką w wykonaniu metodą, pozwalającą ocenić toksyczność i genotoksyczność próbek wody. Jest jedną z metod, które pozwalają monitorować zmiany zachodzące w wodzie przechowywanej w butelkach PET oraz oceniać ich negatywne skutki, co stanowi istotny aspekt dla poznania toksyczności potencjalnie uwalnianych z czasem substancji [5].

Celem proponowanego zadania jest zastosowanie testu Allium do oceny cytotoksyczności i mutagenności wody z opakowań typu PET najpopularniejszych producentów, przechowywanej we względnie wysokiej temperaturze i przez długi okres czasu (kilka miesięcy). Do oceny próbek wód studenci przygotowali i kontrolowali hodowle cebuli zwyczajnej (łac. Allium cepa), uznanej za roślinę wskaźnikową w tego typu badaniach. Obecnie członkowie koła prowadzą obserwacje zarówno w skali makroskopowej (zmiany morfologiczne), jak i mikroskopowej. Korzenie cebuli są pobierane i utrwalane chemicznie. W kolejnym kroku sporządzane są barwione preparaty mikroskopowe, a dane są archiwizowane w postaci zdjęć. Analizy obejmują ocenę uszkodzeń cytogenetycznych oraz wyznaczenie jaki procent komórek w próbie znajduje się w trakcie podziału (tzw. indeks mitotyczny). Ostatnim etapem badania będzie opracowanie statystyczne uzyskanych wyników i ich prezentacja (konferencja naukowa lub/i publikacja).

Studenci zaangażowani w realizację zadania:
Obecnie: Monika Jakoby, Weronika Zakaszewska, Grzegorz Powalski – studenci I i II st. biotechnologii
Wcześniej: Maja Tkaczyk, Maria Pozorska – studentki I st. biotechnologii

Literatura:

  1. Shotyk W. i wsp.: Contamination of Canadian and European bottled waters with antimony from PET containers. Journal of Environmental Monitoring. 2006, nr 8.
  2. Carneado S. i wsp.: Migration of antimony from polyethylene terephthalate used in mineral water bottles. Food Chemistry.01.2015 (online 2014), tom 166, s. 544–550.
  3. Tukur A. i wsp.: PET bottle use patterns and antimony migration into bottled water and soft drinks: the case of British and Nigerian bottles.; Journal of Environmental Monitoring.2012, tom 14(4).
  4. Barrett R. J.: ENDOCRINE DISRUPTORS: Estrogens in a Bottle?; Environmental Health Perspectives.2009, tom 117(6).
  5. Leme DM i wsp.:Allium cepatest in environmental monitoring: A review on its application. Mutation Research. 2009, tom 682(1), str. 71-81.

  • Patologie w genie CFL2, kodującym mięśniową izoformę kofiliny - dr Małgorzata Siatkowska i dr Katarzyna Robaszkiewicz (Katedra Biochemii i Biologii Komórki) 

Kofiliny to globularne białka, które wiążą się do polimerów aktynowych, regulując ich długość poprzez fragmentację i depolimeryzację [1]. Kofiliny to również białka sekwestrujące, które wiążąc wolne podjednostki  aktyny obniżają ich zdolność do przyłączania się do końców filamentu, a przez to spowalniają ich szybkość wydłużania [2]. Między innymi to dzięki aktywności kofiliny utrzymywana jest odpowiednia długość filamentów aktynowych, która jest wymagana do rozwoju siły skurczu w komórkach mięśniowych. 

Mutacje w genie CFL2, kodującym mięśniową izoformę kofiliny, wykryto u pacjentów cierpiących z powodu wrodzonych chorób mięśni – miopatii nemalinowej i miopatii miotubularnej. Wrodzone miopatie są hetero­gennymi chorobami prowadzącymi do osłabienia i utraty napięcia w różnych partiach mięśni szkieletowych, któ­rym towarzyszą poważne zaburzenia struktury komórek mięśniowych.

Muta­cje w CFL2 są bardzo rzadką przyczyną miopatii. Dotąd wykryto dwie substytucje, które prowadzą do zamiany Ala35Thr [3] oraz Val7Met [4] w cząsteczce kofiliny. Przypuszcza się, że w wyniku tych patologii powstają nieprawidłowo zwinięte i niefunkcjonalne kofiliny, których obecność prowadzi do nieprawidłowego rozwoju i funkcjonowania komórek mięśniowych.

Celem projektu jest zaprojektowanie oligonukleotydów zawierających jedną z wymienionych mutacji i przeprowadzenie ukierunkowanej mutagenezy w celu otrzymania zmutowanego wariantu genu CFL2. Powodzenie przeprowadzonych działań na CFL2 zostanie potwierdzone sekwencjonowaniem DNA.

Otrzymane konstrukty zostaną w następnych latach wykorzystane przez członków koła do produkcji mutantów kofiliny i analiz funkcjonalnych z jej udziałem.

Literatura:

  1. Bamburg JR, Bernstein BW. Roles of ADF/cofilin in actin polymerization and beyond. F1000 Biol Rep. 2010 Aug 19;2:62. doi: 10.3410/B2-62. PMID: 21173851; PMCID: PMC2990448.
  2. Hayden SM, Miller PS, Brauweiler A, Bamburg JR. Analysis of the interactions of actin depolymerizing factor with G- and F-actin. Biochemistry. 1993 Sep 28;32(38):9994-10004. doi: 10.1021/bi00089a015. PMID: 8399168
  3. Agrawal PB, Greenleaf RS, Tomczak KK, Lehtokari VL, Wallgren-Pettersson C, Wallefeld W, Laing NG, Darras BT, Maciver SK, Dormitzer PR, Beggs AH. Nemaline myopathy with minicores caused by mutation of the CFL2 gene encoding the skeletal muscle actin-binding protein, cofilin-2. Am J Hum Genet. 2007 Jan;80(1):162-7. doi: 10.1086/510402. Epub 2006 Nov 14. PMID: 17160903; PMCID: PMC1785312.
  4. Ockeloen CW, Gilhuis HJ, Pfundt R, Kamsteeg EJ, Agrawal PB, Beggs AH, Dara Hama-Amin A, Diekstra A, Knoers NV, Lammens M, van Alfen N. Congenital myopathy caused by a novel missense mutation in the CFL2 gene. Neuromuscul Disord. 2012 Jul;22(7):632-9. doi: 10.1016/j.nmd.2012.03.008. Epub 2012 May 4. PMID: 22560515; PMCID: PMC3377783.

Efekty badań

Członkom koła udało się z powodzeniem wyprodukować i oczyścić jednego z zaplanowanych mutantów kofiliny – wariant zawierający substytucję Ala35Thr. Zostały  wykonane pierwsze analizy funkcjonalne, jakim było sprawdzenie wpływu mutacji na wiązanie kofiliny do filamentów aktyny. Członkowie koła przygotowują się również do sprawdzenia jak  mutacja Ala35Thr wpływa na inną aktywność kofiliny, którą jest zdolność do depolimeryzacji filamentów aktyny. Do tych analiz studenci wykorzystają mikroskopię fluorescencyjną oraz analizy zmian fluorescencji z użyciem fluorymetru.

Niestety wyprodukowanie drugiego mutanta Val7Met  było bardzo problematyczne. Studenci spotykali się z niepowodzeniem na etapie mutagenezy. Postanowiono zaprojektować nowe primery pozwalające na wprowadzenie mutacji. Trzymajcie kciuki za powodzenie.